2.2.2 发酵罐分批补料对芽孢率的好氧影响
图6显示了枯草芽孢杆菌GX2的芽孢发酵曲线，同时给出了活菌数和芽孢率随发酵时问的堆肥变化情况。可见，用枯芽孢优化随着发酵时问的草芽X产延长，活菌和芽孢浓度和芽孢率均呈先增加后降低的孢杆变化趋势，发酵至10h和11h时，工艺活菌和芽孢浓度达最大，好氧分别为1.1×1010，堆肥和7.2×109CFu/mL，用枯芽孢优化此时，草芽X产芽孢率也达最大，孢杆为66.6％。工艺此后，好氧活菌数开始下降，堆肥芽孢数也相应降低，用枯芽孢优化说明发酵过程进入衰亡期。在这个基础上，发酵至9h时改变发酵条件，开展后续产芽孢条件优化研究。
2.3 发酵罐产芽孢条件优化
芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，因其具有耐热、抗辐射、耐酸碱及抗化学药物等特殊性质，可有效抵抗外界环境条件的变化，提高存活率，优化芽孢形成条件对微生物菌剂的制备具有一定的实践价值。与菌体的生长繁殖相似，芽孢的形成同样受营养物质及环境条件等多因素的影响，在分批补料发酵培养提高细胞浓度的基础上，对影响枯草芽孢杆菌GX2产芽孢的关键环境条件进行优化，进一步提高芽孢数及芽孢率，可为提高好氧堆肥用微生物菌剂的品质及其实际应用效果奠定技术基础。
2.3.1 培养温度对枯草芽孢杆菌CX2芽孢率的影响
培养温度是影响微生物生长繁殖和芽孢形成的重要环境条件之一，它主要通过影响细胞内生物大分子酶和蛋白质的合成与活性来促进芽孢形成。作者在摇瓶实验优化的最佳培养基条件下进行培养，并采用分批补料技术，使得细胞浓度在培养9h时达到最大，然后调整培养温度，研究温度对芽孢杆菌GX2芽孢率的影响，结果如图7所示。可见，培养温度可在一定程度上影响微生物的生长繁殖及芽孢的形成，随温度升高，活菌及芽孢浓度均呈大致增加的趋势，而芽孢率先升高后降低。当培养温度为35℃时，活菌和芽孢浓度均较低，分别为9.2×109、5.5×109CFU/mL，芽孢率为59.8％。此后，随着培养温度升高，活菌浓度和芽孢数逐步提高，50℃时，芽孢数和芽孢率均最大，分别为7.55×10，CFU/mL和70.6％。当温度进一步升高至55℃时，尽管活菌数和芽孢数略有升高，但芽孢率开始下降，因此，后续产芽孢研究的培养温度采用50℃。
2.3.2 搅拌转速对枯草芽孢杆菌GX2芽孢率的影响
好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2为好氧菌，氧气是其生长繁殖和芽孢生成的重要影响因素。同时，溶解氧对发酵生产的稳定性和生产成本也具有较大影响。发酵罐培养时，发酵液中的溶解氧与通气量和搅拌转速有关，当通气量一定时，可通过调整搅拌转速改变发酵液中的溶解氧浓度，进而优化发酵及产芽孢过程。搅拌转速对枯草芽孢杆菌GX2产芽孢的影响如图8所示。可见，随搅拌转速的升高，活菌浓度不断下降，而芽孢浓度和芽孢率却呈先升高后降低的变化趋势。由于发酵液中的细胞(活菌)浓度较高，约1.2×1010CFU/mL，较高的搅拌转速带来较大的剪切力，不利于细胞存活，因此，随搅拌转速升高活菌数不断下降，这与文献报道一致。同时，随搅拌转速升高，较高的剪切力使得更多营养细胞转化为芽孢，当搅拌转速为100r/min时，芽孢浓度和芽孢率均最大，分别为9.7×109CFU/mL和82.9％，进一步提高搅拌转速，芽孢率开始下降，这与较高转速下活菌数较低有关。
2.3.3 pH对枯草芽孢杆菌GX2芽孢率的影响
不同微生物菌株适宜的pH条件不同，酸碱度影响微生物细胞膜的通透性、膜结构的稳定性以及物质的溶解性或电离性，致使微生物对营养物质的吸收和利用呈现差异，进而影响微生物的生长繁殖，并对芽孢杆菌的芽孢率产生影响。由图9可知，随DH升高，活菌数、芽孢数和芽孢率均呈先升高后降低的变化趋势。当pH为6.8时，活菌浓度最大，为1.25×1010CFU/mL。当pH升高至7.3时，尽管活菌数开始降低，但芽孢浓度和芽孢率达最大，分别为9.7×109CFU/mL和82.9％。进一步升高pH，活菌数、芽孢浓度以及芽孢率均明显降低。
2.3.4 正交试验优化及验证
正交试验是考察关键影响因素综合效应及进行多条件优化的研究方法之一。这里，在单因素优化的基础上，以培养温度、搅拌转速和pH为关键影响因素，选用正交表进3因素3水平的正交试验研究，以活菌数和芽孢数为评价指标，研究关键影响因素对芽孢杆菌GX2产芽孢的综合效应，因素水平设计如表1所示，实验方案设计及结果如表2所示，正交试验极差分析结果如表3所示。结果表明，3个影响因素对活菌数的影响主次顺序为pH＞搅拌转速＞培养温度，由均值κ得出最优组合为A2B2C2，即pH为7.3，培养温度为45℃，搅拌转速为100r/min。从芽孢率角度，3个影响因素的主次顺序与活菌数相似，但其最优组合不同，为A1B3C3，即pH为6.8，培养温度为50℃，搅拌转速为150r/min。
较高的活菌数是提高芽孢率的前提，因此，从优化菌株生产性能，提高芽孢率的角度，选择枯草芽孢杆菌GX2的活菌数和芽孢数均较高的培养条件和方案，确定最优方案为A1B3C3，即pH为6.8，培养温度为50℃，搅拌转速为150r/min，在此条件下进行3L发酵罐试验验证，结果表明，活菌数可达1.57×1010CFU/mL，芽孢数达1.32×1010CFU/mL，芽孢率为84.1％。与单因素优化相比，正交试验优化可进一步提高芽孢杆菌GX2的芽孢率，是其工业化生产应用的重要参考。
3 讨论
好氧堆肥过程中添加微生物菌剂已成为促进堆肥腐熟、缩短堆肥周期的重要方法之一。微生物菌剂的作用效果与活菌数密切相关，随着保存时间的延长，活菌数逐渐减少，影响堆肥效果。芽孢杆菌因其具有较强的抗逆性，能耐热、酸、碱等不良环境，有利于微生物菌剂活性的保持，提高产品质量及应用效果。Huo等通过研究多粘芽孢杆菌孢子和营养细胞在生物有机肥贮藏过程中的活性，发现纯孢子可提高储存期问的存活率和孢子形成。优化芽孢杆菌的产芽孢条件，促进更多营养细胞转化为芽孢。
培养条件优化是产芽孢条件优化的重要前提。作者以实验室保存的堆肥用枯草芽孢杆菌GX2为研究对象，首先进行了摇瓶培养条件及培养基优化，在此基础上，采用分批补料策略在3L发酵罐上进行发酵培养，所得发酵液的0D值和营养细胞浓度可达2.250和1.8×1010CFU/mL。汪晶晶等通过对淀粉芽孢杆菌的培养基及条件优化，发现菌体生长量有明显提高，A600nm由1.228增加至1.6727。
目前，关于芽孢杆菌芽孢率的优化研究多是在摇床上完成的，郭晓军等对堆肥用产蛋白酶的产芽孢条件进行了优化，芽孢率达95％。刘虎军等对枯草芽孢杆菌进行了DH和温度的产芽孢条件优化，生物量和芽孢数分别为5.7×1010、5.2×1010CFU/mL，芽孢率达91％。为实现工业化应用，发酵罐规模的产芽孢条件优化更具参考价值，为此，作者在摇瓶培养条件优化的基础上，结合分批补料发酵技术，在3L发酵罐上进行了产芽孢条件优化，经单因素及正交试验研究，获得了堆肥用枯草芽孢杆菌CX2的最佳产芽孢条件，即pH为6.8，培养温度为50℃，搅拌转速为150r/min，此时，芽孢浓度为1.32×1010CFU/mL，芽孢率为84.1％，研究结果可为芽孢杆菌在微生物菌剂中的工业化应用提供重要参考。
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